利用荧光探针DCFH-DA做活性氧检测，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。

细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

DCFH-DA绿色荧光，如图所示

是整个细胞内均匀的显现绿色荧光。

?染色注意事项：

1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高

2.、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差

3、 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，与测荧光素酶报告基因的板子类似

4、 该荧光很容易淬灭，在荧光显微镜下拍摄时，要快速拍摄，不要墨迹，不然很容易淬灭！如果荧光过强，被激发后可能1～2s就会被动淬灭！

5、 可以从低浓度装载，摸清楚最佳使用浓度，范围大多在：1:1000～1:5000，供参考

?染色protocol：

1、DCFH-DA使用原则：

对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。

对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

贴壁细胞：

使用PBS、HBSS等适当溶液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM/L。

去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA，6孔板可加2ml，5cm皿加入4ml，加入的体积以能充分盖住细胞为宜。

37?C细胞培养箱内孵育20分钟。使用PBS、HBSS、或无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

悬浮细胞：

收集细胞后装载探针：使用浓度一致，也是终浓度为10μM/L，细胞收集后离心去除上清培养基，离心条件为：100rcf，5min。

悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万/ml，37?C细胞培养箱内孵育20分钟。

每隔3-5分钟混匀一下，使探针和细胞充分接触。使用PBS、HBSS、无血清细胞培养液等适当溶液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

可加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。

2、检测后观察

可以用荧光显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测

3、测定

参数设置使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF

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